سنجش میزان تغییر بیان ژن‏های موثر در تولید آلکالوئیدهای دارویی گیاه پروانش در واکنش به فیتوهورمون‏ها از طریق real time pcr

گیاه پروانش (catharanthus roseus) به دلیل دارا بودن خواص درمانی بسیار ارزشمند است. در این گیاه بیش از 130 آلکالوئید از نوع ایندول ترپنوئیدی (tias) وجود دارد که بعضی از آنها کاربرد مهم دارویی دارند. وین بلاستین و وین کریستین دو ماده فعال زیستی می باشند که به عنوان داروهای ضد سرطان در درمان لنفوم و لوسمی استفاده می شوند. این ترکیبات به مقدار کم در اندام هوایی تولید شده و استخراج و خالص سازی آنها هزینه بر است. تلاش زیادی برای افزایش تولید tias انجام شده است که از آن جمله می توان به بهینه سازی محیط کشت، تغذیه مناسب و دستورزی ژنتیکی ژن های مسیر بیوسنتز این مواد اشاره کرد. با وجود تلاش های صورت گرفته، موفقیت چندانی با استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی و کشت ریشه مویی پروانش حاصل نشده است. افزایش تقاضای جهانی برای مصرف این داروها موجب شده تا از روشهای بیوتکنولوژی برای افزایش این آلکالوئیدهای مهم در گیاه استفاده شود. مسیر tia بسیار تنظیم پذیر است، به طوری که تغییر در غلظت پیش ماده ها و یا غلظت پروتئین می تواند توسط فیتو هورمون های گیاهی مانند سالیسیلیک اسید(sa) و جاسمونیک اسید(ja) تنظیم شود. هدف از این مطالعه بررسی اثر القایی دو فیتو هورمون sa و ja بر بیان ژنهای dat، d4h، g10h و str در بافت ساقه و ریشه و تاثیر آن در تجمع آلکالوئیدهای وین کریستین و وین بلاستین است. به این منظور، rna کل از ریشه و برگ گیاهان تیمار شده با 50 میلی مولار ja و 100 میلی مولارsa در زمان صفر ، 6، 24، و 72 ساعت پس از تیمار استخراج شد. cdna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی سنتز شد و الگوی بیان ژن به روش pcr rt- مورد سنجش قرار گرفت. این مطالعه نشان داد که وین بلاستین و وین کریستین در ریشه تولید نمی شوند و دلیل آن عدم بیان ژنهای dat و d4h در این بافت است. بنابراین به نظر می رسد این ژن ها نقش مهمی در تولید آلکالوئیدهای وین بلاستین و وین کریستین داشته باشند. ژن های str و g10h در هر دو بافت ریشه و ساقه بیان شدند اما بیان آنها در ریشه بیشتر از ساقه بود. تجزیه و تحلیل داده ها نشان داد که هر دو فیتو هورمون ja و sa بر بیان این چهار ژن تاثیر مثبت دارند ، هر چند اثر sa به میزان قابل توجهی بیشتر از ja است. آلکالوئیدهای وین بلاستین و وین کریستین ازگیاهان تیمار شده به وسیله روش ریز استخراج مایع با فیبر، خالص سازی شد و توسط روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(hplc) آنالیز گردید. تجزیه و تحلیل داده ها نشان دهنده افزایش میزان وین بلاستین و وین کریستین پس از تیمار با فیتو هورمون ها بود. علاوه بر این مشخص شد که تاثیر sa در افزایش تولید این آلکالوئیدها، همانند افزایش بیان ژنها بیشتر ازja است. بیشترین افزایش در بیان ژن و تولید آلکالوئیدها در 72 ساعت پس از تیمار مشاهده شد. بر اساس نتایج به دست آمده از pcr - rt و hplc، می توان نتیجه گرفت که تیمار با فیتو هورمون ها بیان ژن های دخیل در مسیر tias را افزایش داده و در نتیجه تولید آلکالوئیدهای ضد سرطان وین بلاستین و وین کریستین را تحت تاثیر قرار می دهد.